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È stato sviluppato uno spettrometro a nove colori ultracompatto (54 × 58 × 8,5 mm) e ad ampia apertura (1 × 7 mm), "diviso in due" da una serie di dieci specchi dicroici, utilizzato per l'imaging spettrale istantaneo.Il flusso luminoso incidente con una sezione trasversale inferiore alla dimensione dell'apertura è suddiviso in una striscia continua larga 20 nm e nove flussi di colore con lunghezze d'onda centrali di 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 e 690 nm.Le immagini di nove flussi di colore vengono misurate simultaneamente in modo efficiente dal sensore di immagine.A differenza degli array di specchi dicroici convenzionali, l'array di specchi dicroici sviluppato ha un'esclusiva configurazione in due pezzi, che non solo aumenta il numero di colori che possono essere misurati simultaneamente, ma migliora anche la risoluzione dell'immagine per ciascun flusso di colore.Lo spettrometro a nove colori sviluppato viene utilizzato per l'elettroforesi a quattro capillari.Analisi quantitativa simultanea di otto coloranti che migrano simultaneamente in ciascun capillare utilizzando fluorescenza indotta da laser a nove colori.Poiché lo spettrometro a nove colori non solo è ultra-piccolo ed economico, ma ha anche un elevato flusso luminoso e una risoluzione spettrale sufficiente per la maggior parte delle applicazioni di imaging spettrale, può essere ampiamente utilizzato in vari campi.
L'imaging iperspettrale e multispettrale è diventato una parte importante dell'astronomia2, del telerilevamento per l'osservazione della Terra3,4, del controllo della qualità del cibo e dell'acqua5,6, della conservazione dell'arte e dell'archeologia7, della medicina legale8, della chirurgia9, dell'analisi e della diagnostica biomedica10,11 ecc. Campo 1 Una tecnologia indispensabile ,12,13.I metodi per misurare lo spettro della luce emessa da ciascun punto di emissione nel campo visivo sono suddivisi in (1) scansione puntuale (“scopa”)14,15, (2) scansione lineare (“pannocchia”)16,17,18 , (3) la lunghezza scansiona le onde19,20,21 e (4) le immagini22,23,24,25.Nel caso di tutti questi metodi, la risoluzione spaziale, la risoluzione spettrale e la risoluzione temporale hanno una relazione di compromesso9,10,12,26.Inoltre, l'emissione luminosa ha un impatto significativo sulla sensibilità, ovvero sul rapporto segnale/rumore nell'imaging spettrale26.Il flusso luminoso, ovvero l'efficienza dell'uso della luce, è direttamente proporzionale al rapporto tra la quantità di luce effettiva misurata di ciascun punto luminoso per unità di tempo e la quantità totale di luce nell'intervallo di lunghezze d'onda misurate.La categoria (4) è un metodo appropriato quando l'intensità o lo spettro della luce emessa da ciascun punto di emissione cambia nel tempo o quando la posizione di ciascun punto di emissione cambia nel tempo perché lo spettro della luce emesso da tutti i punti di emissione viene misurato simultaneamente.24.
La maggior parte dei metodi sopra indicati sono combinati con spettrometri grandi, complessi e/o costosi che utilizzano 18 reticoli o 14, 16, 22, 23 prismi per le classi (1), (2) e (4) o 20, 21 dischi filtranti, filtri per liquidi .Filtri accordabili cristallini (LCTF)25 o filtri accordabili acusto-ottici (AOTF)19 della categoria (3).Al contrario, gli spettrometri multispecchio della categoria (4) sono piccoli ed economici grazie alla loro semplice configurazione27,28,29,30.Inoltre, hanno un flusso luminoso elevato perché la luce condivisa da ciascuno specchio dicroico (cioè la luce trasmessa e riflessa della luce incidente su ciascuno specchio dicroico) viene utilizzata completamente e continuamente.Tuttavia, il numero di bande di lunghezze d'onda (cioè di colori) che devono essere misurate contemporaneamente è limitato a circa quattro.
L'imaging spettrale basato sulla rilevazione della fluorescenza è comunemente utilizzato per l'analisi multiplex nel rilevamento e nella diagnostica biomedica 10, 13.Nel multiplexing, poiché più analiti (ad esempio, DNA o proteine specifici) sono marcati con diversi coloranti fluorescenti, ciascun analita presente in ciascun punto di emissione nel campo visivo viene quantificato utilizzando l'analisi multicomponente.32 scompone lo spettro di fluorescenza rilevato emesso da ciascun punto di emissione.Durante questo processo, coloranti diversi, ognuno dei quali emette una fluorescenza diversa, possono colocalizzare, cioè coesistere nello spazio e nel tempo.Attualmente il numero massimo di coloranti che possono essere eccitati da un singolo raggio laser è otto33.Questo limite superiore non è determinato dalla risoluzione spettrale (ovvero dal numero di colori), ma dall'ampiezza dello spettro di fluorescenza (≥50 nm) e dalla quantità di colorante Stokes Shift (≤200 nm) a FRET (utilizzando FRET)10 .Tuttavia, il numero di colori deve essere maggiore o uguale al numero di coloranti per eliminare la sovrapposizione spettrale dei coloranti misti31,32.Pertanto, è necessario aumentare il numero di colori misurati simultaneamente a otto o più.
Recentemente è stato sviluppato uno spettrometro eptacroico ultracompatto (che utilizza una serie di specchi epticroici e un sensore di immagine per misurare quattro flussi fluorescenti).Lo spettrometro è da due a tre ordini di grandezza più piccolo degli spettrometri convenzionali che utilizzano reticoli o prismi34,35.Tuttavia, è difficile posizionare più di sette specchi dicroici in uno spettrometro e misurare contemporaneamente più di sette colori36,37.Con un aumento del numero di specchi dicroici, aumenta la differenza massima nelle lunghezze dei percorsi ottici dei flussi luminosi dicroici e diventa difficile visualizzare tutti i flussi luminosi su un piano sensoriale.Aumenta anche la lunghezza massima del percorso ottico del flusso luminoso, quindi diminuisce l'ampiezza dell'apertura dello spettrometro (cioè l'ampiezza massima della luce analizzata dallo spettrometro).
In risposta ai problemi di cui sopra, è stato sviluppato uno spettrometro ultracompatto a nove colori con un array di specchi decacromatici “dicroici” a due strati e un sensore di immagine per l'imaging spettrale istantaneo [categoria (4)].Rispetto agli spettrometri precedenti, lo spettrometro sviluppato presenta una differenza minore nella lunghezza massima del percorso ottico e una lunghezza massima del percorso ottico inferiore.È stato applicato all'elettroforesi a quattro capillari per rilevare la fluorescenza a nove colori indotta dal laser e per quantificare la migrazione simultanea di otto coloranti in ciascun capillare.Poiché lo spettrometro sviluppato non è solo ultra-piccolo ed economico, ma ha anche un elevato flusso luminoso e una risoluzione spettrale sufficiente per la maggior parte delle applicazioni di imaging spettrale, può essere ampiamente utilizzato in vari campi.
Il tradizionale spettrometro a nove colori è mostrato in fig.1a.Il suo design ricalca quello del precedente spettrometro ultra piccolo a sette colori 31. È costituito da nove specchi dicroici disposti orizzontalmente con un angolo di 45° verso destra e il sensore immagine (S) si trova sopra i nove specchi dicroici.La luce che entra dal basso (C0) viene divisa da una serie di nove specchi dicroici in nove flussi luminosi che salgono verso l'alto (C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 e C9).Tutti e nove i flussi di colore vengono inviati direttamente al sensore di immagine e vengono rilevati simultaneamente.In questo studio, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 e C9 sono in ordine di lunghezza d'onda e sono rappresentati da magenta, viola, blu, ciano, verde, giallo, arancione, rosso-arancio e rosso, rispettivamente.Sebbene queste designazioni di colore siano utilizzate in questo documento, come mostrato nella Figura 3, perché differiscono dai colori reali visti dall'occhio umano.
Diagrammi schematici degli spettrometri convenzionali e nuovi a nove colori.(a) Spettrometro convenzionale a nove colori con una serie di nove specchi dicroici.(b) Nuovo spettrometro a nove colori con una matrice di specchi dicroici a due strati.Il flusso luminoso incidente C0 viene suddiviso in nove flussi luminosi colorati C1-C9 e rilevato dal sensore immagine S.
Il nuovo spettrometro a nove colori sviluppato ha un reticolo di specchio dicroico a due strati e un sensore di immagine, come mostrato in Fig. 1b.Nel livello inferiore, cinque specchi dicroici sono inclinati di 45° a destra, allineati a destra dal centro della serie di decameri.Al livello superiore, cinque specchi dicroici aggiuntivi sono inclinati di 45° a sinistra e posizionati dal centro a sinistra.Lo specchio dicroico più a sinistra dello strato inferiore e lo specchio dicroico più a destra dello strato superiore si sovrappongono.Il flusso luminoso incidente (C0) è suddiviso dal basso in quattro flussi cromatici uscenti (C1-C4) da cinque specchi dicroici a destra e cinque flussi cromatici uscenti (C5-C4) da cinque specchi dicroici a sinistra (C9).Come gli spettrometri convenzionali a nove colori, tutti e nove i flussi di colore vengono iniettati direttamente nel sensore di immagine (S) e rilevati simultaneamente.Confrontando le Figure 1a e 1b, si può vedere che nel caso del nuovo spettrometro a nove colori, sia la differenza massima che la lunghezza del percorso ottico più lungo dei nove flussi di colore sono dimezzate.
La costruzione dettagliata di una serie di specchi dicroici ultra-piccoli a due strati 29 mm (larghezza) × 31 mm (profondità) × 6 mm (altezza) è mostrata nella Figura 2. La serie di specchi dicroici decimali è composta da cinque specchi dicroici sulla destra (M1-M5) e cinque specchi dicroici a sinistra (M6-M9 e un altro M5), ciascuno specchio dicroico è fissato nella staffa superiore in alluminio.Tutti gli specchi dicroici sono sfalsati per compensare lo spostamento parallelo dovuto alla rifrazione del flusso attraverso gli specchi.Sotto M1 è fisso un filtro passa banda (BP).Le dimensioni M1 e BP sono 10 mm (lato lungo) x 1,9 mm (lato corto) x 0,5 mm (spessore).Le dimensioni dei restanti specchi dicroici sono 15 mm × 1,9 mm × 0,5 mm.Il passo della matrice tra M1 e M2 è 1,7 mm, mentre il passo della matrice di altri specchi dicroici è 1,6 mm.Nella fig.2c combina il flusso luminoso incidente C0 e nove flussi luminosi colorati C1-C9, separati da una matrice di specchi de-camera.
Costruzione di una matrice di specchi dicroici a due strati.(a) Una vista prospettica e (b) una vista in sezione trasversale di una serie di specchi dicroici a due strati (dimensioni 29 mm x 31 mm x 6 mm).È costituito da cinque specchi dicroici (M1-M5) situati nello strato inferiore, cinque specchi dicroici (M6-M9 e un altro M5) situati nello strato superiore e un filtro passa banda (BP) situato sotto M1.(c) Vista in sezione trasversale in direzione verticale, con sovrapposizione C0 e C1-C9.
La larghezza dell'apertura nella direzione orizzontale, indicata dalla larghezza C0 in Fig. 2, c, è 1 mm, e nella direzione perpendicolare al piano di Fig. 2, c, data dal design della staffa in alluminio, –7 mm.Cioè, il nuovo spettrometro a nove colori ha un'ampia apertura di 1 mm × 7 mm.Il percorso ottico di C4 è il più lungo tra C1-C9 e il percorso ottico di C4 all'interno della matrice di specchi dicroici, a causa delle dimensioni ultra-piccole di cui sopra (29 mm × 31 mm × 6 mm), è 12 mm.Allo stesso tempo, la lunghezza del percorso ottico di C5 è la più breve tra C1-C9 e la lunghezza del percorso ottico di C5 è 5,7 mm.Pertanto, la differenza massima nella lunghezza del percorso ottico è 6,3 mm.Le lunghezze del percorso ottico sopra indicate sono corrette per la lunghezza del percorso ottico per la trasmissione ottica di M1-M9 e BP (dal quarzo).
Le proprietà spettrali di М1−М9 e VR sono calcolate in modo che i flussi С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8 e С9 siano nell'intervallo di lunghezze d'onda 520–540, 540–560, 560–580, 580 –600, 600–620, 620–640, 640–660, 660–680 e 680–700 nm, rispettivamente.
Una fotografia della matrice prodotta di specchi decacromatici è mostrata in Fig. 3a.M1-M9 e BP sono incollati rispettivamente sulla pendenza di 45 gradi e sul piano orizzontale del supporto in alluminio, mentre M1 e BP sono nascosti sul retro della figura.
Produzione di una serie di specchi decani e sua dimostrazione.(a) Una serie di specchi decacromatici fabbricati.(b) Un'immagine divisa in nove colori di 1 mm × 7 mm proiettata su un foglio di carta posto davanti a una serie di specchi decacromatici e retroilluminato con luce bianca.(c) Una serie di specchi decocromatici illuminati da luce bianca da dietro.(d) Flusso di scissione a nove colori proveniente dalla serie di specchi del decano, osservato posizionando un contenitore acrilico pieno di fumo davanti alla serie di specchi del decano in c e oscurando la stanza.
Gli spettri di trasmissione misurati di M1-M9 C0 con un angolo di incidenza di 45° e lo spettro di trasmissione misurato di BP C0 con un angolo di incidenza di 0° sono mostrati nelle Figg.4a.Gli spettri di trasmissione di C1-C9 relativi a C0 sono mostrati nelle Figg.4b.Questi spettri sono stati calcolati dagli spettri nelle Figg.4a secondo il percorso ottico C1-C9 in Fig. 4a.1b e 2c.Ad esempio, TS(C4) = TS (BP) × [1 − TS (M1)] × TS (M2) × TS (M3) × TS (M4) × [1 − TS (M5)], TS(C9 ) = TS (BP) × TS (M1) × [1 − TS (M6)] × TS (M7) × TS (M8) × TS (M9) × [1 − TS (M5)], dove TS(X) e [ 1 − TS(X)] sono rispettivamente gli spettri di trasmissione e di riflessione di X.Come mostrato nella Figura 4b, le larghezze di banda (larghezza di banda ≥50%) di C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 e C9 sono 521-540, 541-562, 563-580, 581-602, 603 -623, 624-641, 642-657, 659-680 e 682-699 nm.Questi risultati sono coerenti con le gamme sviluppate.Inoltre, l'efficienza di utilizzo della luce C0 è elevata, ovvero la trasmissione luminosa media massima C1-C9 è del 92%.
Spettri di trasmissione di uno specchio dicroico e di un flusso diviso a nove colori.(a) Spettri di trasmissione misurati di M1-M9 con incidenza di 45° e BP con incidenza di 0°.(b) Spettri di trasmissione di C1–C9 relativi a C0 calcolati da (a).
Nella fig.3c, la serie di specchi dicroici è posizionata verticalmente, in modo che il suo lato destro in Fig. 3a sia il lato superiore e il raggio bianco del LED collimato (C0) sia retroilluminato.La serie di specchi decacromatici mostrata nella Figura 3a è montata su un adattatore da 54 mm (altezza) × 58 mm (profondità) × 8,5 mm (spessore).Nella fig.3d, oltre allo stato mostrato in fig.3c, una vasca acrilica piena di fumo è stata posizionata davanti a una serie di specchi decocromatici, con le luci nella stanza spente.Di conseguenza, nel serbatoio sono visibili nove flussi dicroici, provenienti da una serie di specchi decatroici.Ogni flusso diviso ha una sezione trasversale rettangolare con dimensioni di 1 × 7 mm, che corrisponde alla dimensione dell'apertura del nuovo spettrometro a nove colori.Nella Figura 3b, un foglio di carta è posizionato davanti alla serie di specchi dicroici nella Figura 3c e viene osservata un'immagine 1 x 7 mm di nove flussi dicroici proiettati sulla carta dalla direzione del movimento della carta.flussi.I nove flussi di separazione dei colori in fig.3b e d sono C4, C3, C2, C1, C5, C6, C7, C8 e C9 dall'alto verso il basso, come si può vedere anche nelle figure 1 e 2. 1b e 2c.Si osservano in colori corrispondenti alle loro lunghezze d'onda.A causa della bassa intensità della luce bianca del LED (vedere Figura supplementare S3) e della sensibilità della telecamera a colori utilizzata per catturare C9 (682–699 nm) in Fig. Altri flussi di scissione sono deboli.Allo stesso modo, C9 era debolmente visibile ad occhio nudo.Nel frattempo, C2 (il secondo flusso dall'alto) sembra verde nella Figura 3, ma sembra più giallo a occhio nudo.
La transizione dalla Figura 3c a d è mostrata nel Video supplementare 1. Immediatamente dopo che la luce bianca del LED passa attraverso la matrice di specchi decacromatici, si divide simultaneamente in nove flussi di colore.Alla fine, il fumo nel tino si dissipò gradualmente dall'alto verso il basso, così che anche le nove polveri colorate scomparvero dall'alto verso il basso.Al contrario, nel Video supplementare 2, quando la lunghezza d'onda del flusso luminoso incidente sulla serie di specchi decacromatici è stata modificata da lungo a corto nell'ordine di 690, 671, 650, 632, 610, 589, 568, 550 e 532 nm ., Vengono visualizzati solo i corrispondenti flussi suddivisi dei nove flussi suddivisi nell'ordine C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 e C1.Il serbatoio acrilico è sostituito da una vasca di quarzo e le scaglie di ciascun flusso deviato possono essere chiaramente osservate dalla direzione inclinata verso l'alto.Inoltre, il sotto-video 3 viene modificato in modo tale che la parte di modifica della lunghezza d'onda del sotto-video 2 venga riprodotta.Questa è l'espressione più eloquente delle caratteristiche di una schiera di specchi decocromatici.
I risultati di cui sopra mostrano che la serie di specchi decacromatici fabbricati o il nuovo spettrometro a nove colori funziona come previsto.Il nuovo spettrometro a nove colori è formato montando una serie di specchi decacromatici con adattatori direttamente sulla scheda del sensore di immagine.
Flusso luminoso con un intervallo di lunghezze d'onda da 400 a 750 nm, emesso da quattro punti di radiazione φ50 μm, situati a intervalli di 1 mm nella direzione perpendicolare al piano di Fig. 2c, rispettivamente Ricerche 31, 34. La serie di quattro lenti è composta da quattro lenti φ1 mm con una lunghezza focale di 1,4 mm e un passo di 1 mm.Quattro flussi collimati (quattro C0) incidono sul DP di un nuovo spettrometro a nove colori, distanziati ad intervalli di 1 mm.Una serie di specchi dicroici divide ciascun flusso (C0) in nove flussi di colore (C1-C9).I 36 flussi risultanti (quattro serie di C1-C9) vengono quindi iniettati direttamente in un sensore di immagine CMOS (S) collegato direttamente a una serie di specchi dicroici.Di conseguenza, come mostrato in Fig. 5a, a causa della piccola differenza massima del percorso ottico e del breve percorso ottico massimo, le immagini di tutti i 36 flussi sono state rilevate simultaneamente e chiaramente con la stessa dimensione.Secondo gli spettri a valle (vedere Figura supplementare S4), l'intensità dell'immagine dei quattro gruppi C1, C2 e C3 è relativamente bassa.Trentasei immagini avevano una dimensione di 0,57 ± 0,05 mm (media ± DS).Pertanto, l'ingrandimento dell'immagine era in media di 11,4.La spaziatura verticale tra le immagini è in media di 1 mm (la stessa spaziatura di una serie di lenti) e la spaziatura orizzontale è in media di 1,6 mm (la stessa spaziatura di una serie di specchi dicroici).Poiché la dimensione dell'immagine è molto inferiore alla distanza tra le immagini, ciascuna immagine può essere misurata in modo indipendente (con diafonia bassa).Nel frattempo, le immagini di ventotto flussi registrati dallo spettrometro convenzionale a sette colori utilizzato nel nostro studio precedente sono mostrate in Fig. 5 B. La serie di sette specchi dicroici è stata creata rimuovendo i due specchi dicroici più a destra dalla serie di nove specchi dicroici specchi nella Figura 1a.Non tutte le immagini sono nitide, la dimensione dell'immagine aumenta da C1 a C7.Ventotto immagini hanno una dimensione di 0,70 ± 0,19 mm.Pertanto, è difficile mantenere un'elevata risoluzione dell'immagine in tutte le immagini.Il coefficiente di variazione (CV) per la dimensione dell'immagine 28 nella Figura 5b era del 28%, mentre il CV per la dimensione dell'immagine 36 nella Figura 5a è sceso al 9%.I risultati di cui sopra mostrano che il nuovo spettrometro a nove colori non solo aumenta il numero di colori misurati simultaneamente da sette a nove, ma ha anche un'elevata risoluzione dell'immagine per ciascun colore.
Confronto della qualità dell'immagine divisa formata da spettrometri convenzionali e nuovi.(a) Quattro gruppi di immagini separate a nove colori (C1-C9) generate dal nuovo spettrometro a nove colori.(b) Quattro serie di immagini separate a sette colori (C1-C7) formate con uno spettrometro convenzionale a sette colori.I flussi (C0) con lunghezze d'onda da 400 a 750 nm provenienti da quattro punti di emissione sono rispettivamente collimati e incidenti su ciascuno spettrometro.
Le caratteristiche spettrali dello spettrometro a nove colori sono state valutate sperimentalmente e i risultati della valutazione sono mostrati nella Figura 6. Si noti che la Figura 6a mostra gli stessi risultati della Figura 5a, ovvero a lunghezze d'onda di 4 C0 400–750 nm, vengono rilevate tutte le 36 immagini (4 gruppi C1–C9).Al contrario, come mostrato in Fig. 6b-j, quando ogni C0 ha una lunghezza d'onda specifica di 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 o 690 nm, ci sono quasi solo quattro immagini corrispondenti (quattro gruppi rilevati C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 o C9).Tuttavia, alcune delle immagini adiacenti alle quattro immagini corrispondenti vengono rilevate molto debolmente perché gli spettri di trasmissione C1-C9 mostrati in Fig. 4b si sovrappongono leggermente e ciascun C0 ha una banda di 10 nm a una lunghezza d'onda specifica come descritto nel metodo.Questi risultati sono coerenti con gli spettri di trasmissione C1-C9 mostrati nelle Figg.4b e video supplementari 2 e 3. In altre parole, lo spettrometro a nove colori funziona come previsto in base ai risultati mostrati in fig.4b.Pertanto, si conclude che la distribuzione dell'intensità dell'immagine C1-C9 è lo spettro di ciascun C0.
Caratteristiche spettrali di uno spettrometro a nove colori.Il nuovo spettrometro a nove colori genera quattro serie di immagini separate a nove colori (C1-C9) quando la luce incidente (quattro C0) ha una lunghezza d'onda di (a) 400-750 nm (come mostrato nella Figura 5a), (b) 530 nm.nm, (c) 550 nm, (d) 570 nm, (e) 590 nm, (f) 610 nm, (g) 630 nm, (h) 650 nm, (i) 670 nm, (j) 690 nm, rispettivamente.
Lo spettrometro a nove colori sviluppato è stato utilizzato per l'elettroforesi a quattro capillari (per dettagli, vedere Materiali supplementari)31,34,35.La matrice quadricapillare è costituita da quattro capillari (diametro esterno 360 μm e diametro interno 50 μm) situati a intervalli di 1 mm nel sito di irradiazione laser.Campioni contenenti frammenti di DNA etichettati con 8 coloranti, vale a dire FL-6C (colorante 1), JOE-6C (colorante 2), dR6G (colorante 3), TMR-6C (colorante 4), CXR-6C (colorante 5), TOM- 6C (colorante 6), LIZ (colorante 7) e WEN (colorante 8) in ordine crescente di lunghezza d'onda fluorescente, separati in ciascuno dei quattro capillari (di seguito denominati Cap1, Cap2, Cap3 e Cap4).La fluorescenza indotta dal laser da Cap1-Cap4 è stata collimata con una serie di quattro lenti e registrata simultaneamente con uno spettrometro a nove colori.La dinamica dell'intensità della fluorescenza a nove colori (C1-C9) durante l'elettroforesi, ovvero un elettroforegramma a nove colori di ciascun capillare, è mostrata in Fig. 7a.Un elettroforegramma equivalente a nove colori si ottiene in Cap1-Cap4.Come indicato dalle frecce Cap1 nella Figura 7a, gli otto picchi su ciascun elettroforegramma a nove colori mostrano rispettivamente un'emissione di fluorescenza da Dye1-Dye8.
Quantificazione simultanea di otto coloranti utilizzando uno spettrometro per elettroforesi a quattro capillari a nove colori.(a) Elettroforegramma a nove colori (C1-C9) di ciascun capillare.Gli otto picchi indicati dalle frecce Cap1 mostrano le singole emissioni di fluorescenza di otto coloranti (Dye1-Dye8).I colori delle frecce corrispondono ai colori (b) e (c).(b) Spettri di fluorescenza di otto coloranti (Dye1-Dye8) per capillare.c Elettroferogrammi di otto coloranti (Dye1-Dye8) per capillare.I picchi dei frammenti di DNA marcati con Dye7 sono indicati da frecce e sono indicate le lunghezze delle loro basi Cap4.
Le distribuzioni di intensità di C1 – C9 su otto picchi sono mostrate nelle Figg.7b, rispettivamente.Poiché sia C1-C9 che Dye1-Dye8 sono in ordine di lunghezza d'onda, le otto distribuzioni in Fig. 7b mostrano gli spettri di fluorescenza di Dye1-Dye8 in sequenza da sinistra a destra.In questo studio, Dye1, Dye2, Dye3, Dye4, Dye5, Dye6, Dye7 e Dye8 appaiono rispettivamente in magenta, viola, blu, ciano, verde, giallo, arancione e rosso.Si noti che i colori delle frecce nella Fig. 7a corrispondono ai colori della tintura nella Fig. 7b.Le intensità di fluorescenza C1-C9 per ciascuno spettro nella Figura 7b sono state normalizzate in modo che la loro somma sia uguale a uno.Otto spettri di fluorescenza equivalenti sono stati ottenuti da Cap1-Cap4.Si può osservare chiaramente la sovrapposizione spettrale della fluorescenza tra il colorante 1 e il colorante 8.
Come mostrato nella Figura 7c, per ciascun capillare, l'elettroforegramma a nove colori nella Figura 7a è stato convertito in un elettroferogramma a otto coloranti mediante analisi multicomponente basata sugli otto spettri di fluorescenza nella Figura 7b (vedere Materiali supplementari per i dettagli).Poiché la sovrapposizione spettrale della fluorescenza nella Figura 7a non è visualizzata nella Figura 7c, Dye1-Dye8 può essere identificato e quantificato individualmente in ogni punto temporale, anche se diverse quantità di Dye1-Dye8 fluorescenza allo stesso tempo.Ciò non può essere fatto con il tradizionale rilevamento a sette colori31, ma può essere ottenuto con il rilevamento a nove colori sviluppato.Come mostrato dalle frecce Cap1 in Fig. 7c, solo le canottiere a emissione fluorescente Dye3 (blu), Dye8 (rosso), Dye5 (verde), Dye4 (ciano), Dye2 (viola), Dye1 (magenta) e Dye6 (giallo ) vengono osservati nell'ordine cronologico previsto.Per l'emissione fluorescente del colorante 7 (arancione), oltre al singolo picco indicato dalla freccia arancione, sono stati osservati diversi altri picchi singoli.Questo risultato è dovuto al fatto che i campioni contenevano standard di dimensione, frammenti di DNA etichettati con Dye7 con diverse lunghezze di base.Come mostrato nella Figura 7c, per Cap4 queste lunghezze di base sono 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214 e 220 lunghezze di base.
Le caratteristiche principali dello spettrometro a nove colori, sviluppato utilizzando una matrice di specchi dicroici a due strati, sono le dimensioni ridotte e il design semplice.Poiché la disposizione degli specchi decacromatici all'interno dell'adattatore mostrato in fig.3c montato direttamente sulla scheda del sensore immagine (vedi Fig. S1 e S2), lo spettrometro a nove colori ha le stesse dimensioni dell'adattatore, ovvero 54 × 58 × 8,5 mm.(spessore).Questa dimensione ultra piccola è di due o tre ordini di grandezza inferiore rispetto agli spettrometri convenzionali che utilizzano reticoli o prismi.Inoltre, poiché lo spettrometro a nove colori è configurato in modo tale che la luce colpisce perpendicolarmente la superficie del sensore di immagine, lo spazio può essere facilmente allocato per lo spettrometro a nove colori in sistemi come microscopi, citometri a flusso o analizzatori.Analizzatore di elettroforesi a reticolo capillare per una miniaturizzazione ancora maggiore del sistema.Allo stesso tempo, la dimensione di dieci specchi dicroici e filtri passa-banda utilizzati nello spettrometro a nove colori è di soli 10×1,9×0,5 mm o 15×1,9×0,5 mm.Pertanto, più di 100 di questi piccoli specchi dicroici e filtri passa banda, rispettivamente, possono essere tagliati rispettivamente da uno specchio dicroico e da un filtro passa banda da 60 mm2.Pertanto, è possibile produrre una serie di specchi decacromatici a basso costo.
Un'altra caratteristica dello spettrometro a nove colori sono le sue eccellenti caratteristiche spettrali.In particolare consente l'acquisizione di immagini spettrali di istantanee, ovvero l'acquisizione simultanea di immagini con informazioni spettrali.Per ciascuna immagine è stato ottenuto uno spettro continuo con un intervallo di lunghezze d'onda da 520 a 700 nm e una risoluzione di 20 nm.In altre parole, per ogni immagine vengono rilevate nove intensità di colore della luce, ovvero nove bande da 20 nm che dividono equamente l'intervallo di lunghezze d'onda da 520 a 700 nm.Modificando le caratteristiche spettrali dello specchio dicroico e del filtro passa banda, è possibile regolare la gamma di lunghezze d'onda delle nove bande e la larghezza di ciascuna banda.Il rilevamento a nove colori può essere utilizzato non solo per misurazioni di fluorescenza con imaging spettrale (come descritto in questo rapporto), ma anche per molte altre applicazioni comuni che utilizzano l'imaging spettrale.Sebbene l'imaging iperspettrale possa rilevare centinaia di colori, si è scoperto che anche con una riduzione significativa del numero di colori rilevabili, più oggetti nel campo visivo possono essere identificati con sufficiente precisione per molte applicazioni38,39,40.Poiché la risoluzione spaziale, la risoluzione spettrale e la risoluzione temporale hanno un compromesso nell'imaging spettrale, la riduzione del numero di colori può migliorare la risoluzione spaziale e temporale.Può anche utilizzare semplici spettrometri come quello sviluppato in questo studio e ridurre ulteriormente la quantità di calcoli.
In questo studio, otto coloranti sono stati quantificati simultaneamente mediante separazione spettrale dei loro spettri di fluorescenza sovrapposti in base al rilevamento di nove colori.È possibile quantificare simultaneamente fino a nove coloranti, che coesistono nel tempo e nello spazio.Un vantaggio speciale dello spettrometro a nove colori è l'elevato flusso luminoso e l'ampia apertura (1 × 7 mm).La serie di specchi del decano ha una trasmissione massima del 92% della luce proveniente dall'apertura in ciascuno dei nove intervalli di lunghezze d'onda.L'efficienza dell'utilizzo della luce incidente nell'intervallo di lunghezze d'onda da 520 a 700 nm è quasi del 100%.In una gamma così ampia di lunghezze d'onda, nessun reticolo di diffrazione può fornire un'efficienza di utilizzo così elevata.Anche se l’efficienza di diffrazione di un reticolo di diffrazione supera il 90% ad una certa lunghezza d’onda, all’aumentare della differenza tra quella lunghezza d’onda e una particolare lunghezza d’onda, l’efficienza di diffrazione ad un’altra lunghezza d’onda diminuisce41.La larghezza dell'apertura perpendicolare alla direzione del piano in Fig. 2c può essere estesa da 7 mm alla larghezza del sensore di immagine, come nel caso del sensore di immagine utilizzato in questo studio, modificando leggermente la matrice del decamero.
Lo spettrometro a nove colori può essere utilizzato non solo per l'elettroforesi capillare, come mostrato in questo studio, ma anche per vari altri scopi.Ad esempio, come mostrato nella figura seguente, è possibile applicare uno spettrometro a nove colori a un microscopio a fluorescenza.Il piano del campione viene visualizzato sul sensore immagine dello spettrometro a nove colori attraverso un obiettivo 10x.La distanza ottica tra la lente dell'obiettivo e il sensore immagine è di 200 mm, mentre la distanza ottica tra la superficie incidente dello spettrometro a nove colori e il sensore immagine è di soli 12 mm.Pertanto, l'immagine è stata tagliata approssimativamente alla dimensione dell'apertura (1 × 7 mm) nel piano di incidenza e divisa in nove immagini a colori.Cioè, è possibile acquisire un'immagine spettrale di un'istantanea a nove colori su un'area di 0,1×0,7 mm nel piano campione.Inoltre, è possibile ottenere un'immagine spettrale a nove colori di un'area più ampia sul piano del campione scansionando il campione rispetto all'obiettivo nella direzione orizzontale in Fig. 2c.
I componenti della matrice di specchi decacromatici, vale a dire M1-M9 e BP, sono stati realizzati su misura da Asahi Spectra Co., Ltd. utilizzando metodi di precipitazione standard.Materiali dielettrici multistrato sono stati applicati singolarmente su dieci lastre di quarzo di dimensioni 60×60 mm e spessore 0,5 mm, rispondenti ai seguenti requisiti: M1: IA = 45°, R ≥ 90% a 520–590 nm, Tave ≥ 90% a 610– 610 nm.700 nm, M2: IA = 45°, R ≥ 90% a 520–530 nm, Tave ≥ 90% a 550–600 nm, M3: IA = 45°, R ≥ 90% a 540–550 nm, Tave ≥ 90 % a 570–600 nm, M4: IA = 45°, R ≥ 90% a 560–570 nm, Tave ≥ 90% a 590–600 nm, M5: IA = 45°, R ≥ 98% a 580–600 nm , R ≥ 98% a 680–700 nm, M6: IA = 45°, Tave ≥ 90% a 600–610 nm, R ≥ 90% a 630–700 nm, M7: IA = 45°, R ≥ 90% a 620–630 nm, Taw ≥ 90% a 650–700 nm, M8: IA = 45°, R ≥ 90% a 640–650 nm, Taw ≥ 90% a 670–700 nm, M9: IA = 45°, R ≥ 90% a 650-670 nm, Tave ≥ 90% a 690-700 nm, BP: IA = 0°, T ≤ 0,01% a 505 nm, Tave ≥ 95% a 530-690 nm a 530 nm T ≥ 90% a -690 nm e T ≤ 1% a 725-750 nm, dove IA, T, Tave e R sono l'angolo di incidenza, la trasmittanza, la trasmittanza media e la riflettanza della luce non polarizzata.
La luce bianca (C0) con un intervallo di lunghezze d'onda di 400–750 nm emessa da una sorgente luminosa a LED (AS 3000, AS ONE CORPORATION) è stata collimata e incidente verticalmente sul DP di una serie di specchi dicroici.Lo spettro della luce bianca dei LED è mostrato nella Figura supplementare S3.Posizionare un serbatoio acrilico (dimensioni 150 × 150 × 30 mm) direttamente davanti all'array di specchi decamera, di fronte all'alimentatore.Il fumo generato quando il ghiaccio secco veniva immerso nell'acqua è stato poi versato in una vasca acrilica per osservare i flussi divisi a nove colori C1-C9 provenienti dalla serie di specchi decacromatici.
In alternativa, la luce bianca collimata (C0) viene fatta passare attraverso un filtro prima di entrare nel DP.I filtri erano originariamente filtri a densità neutra con una densità ottica di 0,6.Quindi utilizzare un filtro motorizzato (FW212C, FW212C, Thorlabs).Infine, riattiva il filtro ND.Le larghezze di banda dei nove filtri passa banda corrispondono rispettivamente a C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 e C1.Una cella di quarzo con dimensioni interne di 40 (lunghezza ottica) x 42,5 (altezza) x 10 mm (larghezza) è stata posizionata davanti a una serie di specchi decocromatici, di fronte al BP.Il fumo viene quindi alimentato attraverso un tubo nella cella di quarzo per mantenere la concentrazione di fumo nella cella di quarzo per visualizzare i flussi divisi C1-C9 a nove colori provenienti dalla matrice di specchi decacromatici.
Un video del flusso di luce diviso in nove colori proveniente da una serie di specchi decanici è stato catturato in modalità time-lapse su iPhone XS.Cattura immagini della scena a 1 fps e compila le immagini per creare video a 30 fps (per video opzionale 1) o 24 fps (per video opzionali 2 e 3).
Posizionare una piastra in acciaio inossidabile spessa 50 µm (con quattro fori da 50 µm di diametro a intervalli di 1 mm) sulla piastra di diffusione.Sulla piastra diffusore viene irradiata luce con lunghezza d'onda di 400-750 nm, ottenuta facendo passare la luce di una lampada alogena attraverso un filtro di trasmissione corto con lunghezza d'onda di taglio di 700 nm.Lo spettro della luce è mostrato nella Figura supplementare S4.In alternativa, la luce passa anche attraverso uno dei filtri passa-banda da 10 nm centrati a 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 e 690 nm e colpisce la piastra del diffusore.Di conseguenza, su una piastra di acciaio inossidabile di fronte alla piastra del diffusore si sono formati quattro punti di radiazione con un diametro di φ50 μm e diverse lunghezze d'onda.
Una matrice a quattro capillari con quattro lenti è montata su uno spettrometro a nove colori come mostrato nelle Figure 1 e 2. C1 e C2.I quattro capillari e le quattro lenti erano gli stessi degli studi precedenti31,34.Un raggio laser con una lunghezza d'onda di 505 nm e una potenza di 15 mW viene irradiato contemporaneamente e in modo uniforme lateralmente verso i punti di emissione di quattro capillari.La fluorescenza emessa da ciascun punto di emissione viene collimata dalla lente corrispondente e separata in nove flussi di colore da una serie di specchi decacromatici.I 36 flussi risultanti sono stati poi iniettati direttamente in un sensore di immagine CMOS (C11440–52U, Hamamatsu Photonics K·K.) e le loro immagini sono state registrate simultaneamente.
ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), 4 µl di colorante GeneScan™ 600 LIZ™ sono stati miscelati per ciascun capillare miscelando 1 µl di PowerPlex® 6C Matrix Standard (Promega Corporation), 1 µl di mix size standard.v2.0 (Thermo Fisher Scientific) e 14 µl di acqua.Lo standard PowerPlex® 6C Matrix è costituito da sei frammenti di DNA etichettati con sei coloranti: FL-6C, JOE-6C, TMR-6C, CXR-6C, TOM-6C e WEN, in ordine di lunghezza d'onda massima.Le lunghezze delle basi di questi frammenti di DNA non sono divulgate, ma la sequenza della lunghezza delle basi dei frammenti di DNA marcati con WEN, CXR-6C, TMR-6C, JOE-6C, FL-6C e TOM-6C è nota.La miscela contenuta nel kit ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit contiene un frammento di DNA marcato con colorante dR6G.Anche le lunghezze delle basi dei frammenti di DNA non vengono divulgate.GeneScan™ 600 LIZ™ Dye Size Standard v2.0 include 36 frammenti di DNA marcati con LIZ.Le lunghezze delle basi di questi frammenti di DNA sono 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 314, 320, 340, 360, 380, 400, 414, 420, 440, 460, 480, 500, 514, 520, 540, 560, 580 e 600 base.I campioni sono stati denaturati a 94°C per 3 minuti, quindi raffreddati su ghiaccio per 5 minuti.I campioni sono stati iniettati in ciascun capillare a 26 V/cm per 9 s e separati in ciascun capillare riempito con una soluzione di polimero POP-7™ (Thermo Fisher Scientific) con una lunghezza effettiva di 36 cm e una tensione di 181 V/cm e un angolo di 60°.DA.
Tutti i dati ottenuti o analizzati nel corso di questo studio sono inclusi in questo articolo pubblicato e nelle sue informazioni aggiuntive.Altri dati rilevanti per questo studio sono disponibili presso i rispettivi autori su ragionevole richiesta.
Khan, MJ, Khan, HS, Yousaf, A., Khurshid, K. e Abbas, A. Tendenze attuali nell'analisi dell'imaging iperspettrale: una revisione.Accedi a IEEE 6, 14118–14129.https://doi.org/10.1109/ACCESS.2018.2812999 (2018).
Vaughan, AH Spettroscopia interferometrica astronomica di Fabry-Perot.installare.Reverendo Astron.astrofisica.5, 139-167.https://doi.org/10.1146/annurev.aa.05.090167.001035 (1967).
Goetz, AFH, Wein, G., Solomon, JE e Rock, BN Spettroscopia delle immagini di telerilevamento della Terra.Scienza 228, 1147–1153.https://doi.org/10.1126/science.228.4704.1147 (1985).
Yokoya, N., Grohnfeldt, C. e Chanussot, J. Fusione di dati iperspettrali e multispettrali: una revisione comparativa di recenti pubblicazioni.Scienze della Terra dell'IEEE.Giornale di telerilevamento.5:29–56.https://doi.org/10.1109/MGRS.2016.2637824 (2017).
Gowen, AA, O'Donnell, SP, Cullen, PJ, Downey, G. e Frias, JM L'imaging iperspettrale è un nuovo strumento analitico per il controllo di qualità e la sicurezza alimentare.Tendenze nella scienza dell'alimentazione.tecnologia.18, 590-598.https://doi.org/10.1016/j.tifs.2007.06.001 (2007).
ElMasri, G., Mandour, N., Al-Rejaye, S., Belin, E. e Rousseau, D. Recenti applicazioni dell'imaging multispettrale per il monitoraggio del fenotipo e della qualità dei semi: una revisione.Sensori 19, 1090 (2019).
Liang, H. Progressi nell'imaging multispettrale e iperspettrale per l'archeologia e la conservazione dell'arte.Richiedi un fisico 106, 309–323.https://doi.org/10.1007/s00339-011-6689-1 (2012).
Edelman GJ, Gaston E., van Leeuwen TG, Cullen PJ e Alders MKG Imaging iperspettrale per l'analisi senza contatto di tracce forensi.Criminalistica.interno 223, 28-39.https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2012.09.012 (2012).
Orario di pubblicazione: 10 gennaio 2023